La malattia fistolosa viene solitamente diagnosticata da un proctologo dopo aver ascoltato i disturbi del paziente ed aver effettuato un esame fisico. Se necessario, possono essere applicati anche alcuni metodi diagnostici aggiuntivi. Ad esempio, colonscopia, sigmoidoscopia, fistulogramma o endoscopia. Nella maggior parte dei casi, la possibilità di formazione di fistole viene determinata da un esame dettagliato della zona rettale dei pazienti che lamentano infiammazioni.
È possibile eseguire un esame indolore con una tecnica diagnostica della fistola chiamata test del colorante blu (blu di metilene). Inoltre, uno dei metodi più comunemente utilizzati è un esame anoscopico dettagliato. Una procedura chiamata rettoscopia viene eseguita utilizzando un dispositivo endoscopico e consente di diagnosticare altre malattie anali, come emorroidi e ragadi, insieme alla fistola, se presente. È possibile eseguire un esame più dettagliato anche utilizzando un apparecchio per sigmoidoscopia. Grazie al dispositivo per la colonscopia, oltre alla fistola, è possibile diagnosticare malattie del retto come il morbo di Crohn, che può essere la causa principale dei sintomi. Utilizzando una tecnica chiamata fistulografia, viene iniettato un liquido blu attraverso l’apertura esterna della fistola, che consente di identificare i canali fistolosi che si sono formati all’interno.